当归贝母苦参丸出自《金匮要略》，原为治疗妊娠小便难，具有活血补血，化痰散结，清热解毒的功效。与肿瘤的发病正气不足，痰( 湿) 浊、热毒、瘀血内阻有着共同机制。近年来以用其加味治疗宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌取得明显疗效。其中绝大多数研究都是针对下焦癌变进行，而本研究拓展思路，将研究目光转向中焦胃癌。从基因转录水平和蛋白表达水平检测环氧化酶( cyclooxygenase，COX) ，Bcl-2 相关X 蛋白( Bcl-2 associated Xprotein，Bax ) ，抑癌基因( phosphatase and tensinhomolog dele ted on chromosome ten，PTEN) ，在细胞内的表达，探讨当归贝母苦参丸含药血清抑制胃癌细胞SGC-7901 的机制，为中医药经方抗肿瘤研究提供理论基础。
1 材料
1. 1 动物及细胞
株SPF 级Waster 大鼠，合格证号SCXK( 甘) 2011-0001，体重( 180 20) g，雌雄各半，由甘肃中医学院科研中心动物实验室提供。饲养条件: 室温20 ～ 25 ℃，湿度45% ～ 55%。动物分笼饲养，食标准饲料，饮水自由，饲料由甘肃中医学院科研中心动物实验室提供。人胃癌SGC-7901 细胞株购于北京协和肿瘤研究所。
1. 2 药物及试剂
当归、贝母、苦参购自甘肃中医学院附属医院。DMEM 培养基、胎牛血清( 美国HyClone 公司) ，四甲基偶氮唑蓝( 上海华舜生物工程有限公司) ，二抗( 中杉金桥生物技术有限公司) ，RNAisoTMPlus( 批号D9810A) ， the PrimeSeript RTreagent，kit( 批号DRRO37A) ，SYBR Premix Ex TaqTM( 批号DRR081A，英国TakarBio 公司) ，国产分析纯试剂( 北京化学试剂公司) 。
1. 3 仪器
SW-CJ-1D 型超净工作台( 苏州苏洁净化设备有限公司) ，MCO-18AIC 型CO2培养箱( 日本三洋公司) ，CKX41 /U-RFLT50 型荧光倒置显微镜( 日本Olympus 公司) ，5804R 型高速冷冻离心机( 德国Eppendorf 公司) ，Bio-Rad CFX96 型荧光PCR仪( 美国伯乐公司) 。
2 方法
2. 1 含药血清制备
2. 1. 1 中药汤液制备将各复方中药药物饮片浸泡1 h，煎煮2 次，每次30 min，纱布粗滤去渣，药液浓缩为含生药1，2，3gmL - 1。
2. 1. 2 给药剂量方式及采血方法按完全随机化分组方法，将120 只大鼠分为当归贝母苦参丸高、中、底剂量组和空白空白组，每组30 只，中药组和空白组大鼠每天分别灌服中药和生理盐水0. 01 mLg - 1，2 次/d，均连续给药7 d，正常饮食饮水。对每只大鼠于末次给药2 h 后，乙醚麻醉，腹主动脉采血，3 000 rmin - 1，15 min 离心分离血清，将各组已取备的30 支血清混合，0. 22 m 微孔滤膜过滤，56 ℃，30 min 灭活，- 80 ℃保存备用。
2. 2 细胞培养人
胃癌细胞株SGC-7901 接种于无菌培养瓶中，其中1 组加入空白大鼠血清，其中1 组加入10%胎牛血清作为空白组，用于检验空白大鼠血清的特异性，其他3 组加入不同浓度的含药血清;每组都加入含双抗的DMEM 培养基，在37 ℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。细胞单层贴壁培养，达到对数生长期时用0. 25% 胰酶，37 ℃ 条件下消化，吹打成细胞悬液后接种传代。
2. 3 MTT 法检测
细胞增殖取生长状态好，处于对数生长期的细胞，制备成密度为5 104 /mL 细胞悬液。96 孔板每孔加入细胞悬液100 L，细胞贴壁后，实验组加入不同浓度的含药血清与培养液，空白组加入等量的完全培养液，每个剂量设8 个复孔。于24，48，72 h 后，各取一块96 孔培养板，每孔加入浓度为5 gL - 1 的MTT 20 L。4 h 后弃去培养基，每孔加DMSO 150 L，摇床震荡10 min，酶联仪于570 nm 处测出各孔吸光度A，按下式计算细胞抑制率。细胞抑制率= ( A空白组- A给药组/A空白组) 100%。
2. 4 RT-qPCR 检测
COX-2，Bax，PTEN 的mRNA 表达水平总RNA 提取: 分别将空白血清和含药血清处理24 h 的SGC-7901 细胞用PBS 清洗2 次，加入预冷的Trizol 1 mL，冰上静置10 min，使用细胞刮刮除细胞，转移至RNA 酶处理过的1. 5 mL EP 管中，加入0. 2 mL 三氯甲烷，剧烈混匀，冰上静置5 min;4 ℃，12 000 rmin - 1离心，15 min; 之后可见分层，小心吸取上清约0. 5 mL; 加入0. 5 mL 异丙醇，上下混匀，冰上静置10 min; 4 ℃，10 500 rmin - 1 离心10 min，可见核酸沉淀，弃上清，加入75%乙醇溶解;4 ℃，8 500 rmin - 1 离心5 min，弃上清; 干燥5 min后加入适量DEPC 水，存于- 80 ℃。提取RNA 进行浓度纯度检测后，用TaKaRa 逆转录试剂盒逆转录合成cDNA。使用CFX96 Real-Time 荧光PCR 仪扩增目的基因。COX-2 上游引物3-GCCTGAATGTGCCATAAGACTG-5，下游引物3-AAACCCACAGTGCTTGACACA-5 Bax 上游引物3-GGATGCGTCCACCAAGAAG-5， 下游引物3-GCAAAGTAGAAAAGGGCGACA-5 PTEN 上游引物3-GACTCTGGAATATCCCTGGACA-5，下游引物3-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-5。采用荧光定量PCR 试剂盒说明操作，使用CFX96 Real-Time 荧光PCR 仪扩增，条件为: 95 ℃10 s 预变性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s 40 个循环分析溶解曲线，确认扩增产物的特异性，相对表达量计算采取2 - Ct法计算。
2. 5 免疫细胞化学技术检测
COX-2，Bax，PTEN 蛋白量的表达在24 孔培养板中每孔置入无菌10 mm 10 mm 的盖玻片，将对数生长期的胃癌SGC-7901 细胞消化成单细胞悬液，接种于24 孔培养板中，每孔500 细胞贴壁后，空白组加入50 L完全培养基，余孔加入空白血清、高、中、低含药血清各50 L，每组设3 个复孔。待细胞爬满盖玻片后，将爬片置于4% 多聚甲醛中过夜，PBS 洗3次，5min /次; 滴加50 L 0. 1% Triton X-100 室温下孵育15 min，PBS 洗3 次，5 min /次; 滴加3% H2O2室温下孵育30 min，PBS 洗3 次，5min /次; 滴加50L 5%BSA 封闭液，室温20 min，甩去多余液体; 滴加50 L 稀释过的Rabbit Anti-collagen Type Ⅱ( 1∶ 100) ，湿盒中4 ℃孵育过夜; 以PBS 代替一抗，作为阴性对照，PBS 洗3 次，2min /次; 滴加生物素化山羊抗兔IG， 37 ℃ 20 min，PBS 洗3 次，2min /次; 滴加试剂SABC，37 ℃ 20 min，PBS 洗4 次，5min /次;DAB 显色，自来水冲洗1 min; 苏木素复染5 min，0. 5%盐酸乙醇分化10 s，氨水返蓝10 s; 梯度乙醇( 70%，75%，80%，85%，95%，100%) 脱水干燥，每一个梯度5 min，二甲苯透明10 s，甘油封片。倒置相差显微镜观察照相。每张爬片选择3 个高倍视野，使用图像费你先软件对所拍照片进行分析，测定相对灰度值。
2. 6 统计学分析
采用SPSS 19. 0 统计软件分析数据，计量资料以珋x s 表示，多组间采用单因素方差分析，以P 0. 05 为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 对SGC-7901 细胞增殖抑制的影响
MTT 法检测细胞活力，空白血清组与空白组相比较，差异不大，所以在下列比较过程中将把空白组作为基准组。发现10%浓度的当归贝母苦参丸含药血清对人胃癌SGC-7901 细胞抑制作用最明显，与空白组比较，含药血清高、中、低组细胞的A 明显降低，SGC-7901细胞组72 h 的抑制率分别为: 高剂量组达到35. 21%，中剂量组为32. 39%，低剂量组为21. 12%; 差异有统计学意义( P 0. 05) 。
3. 2对SGC-7901 细胞
COX-2，Bax，PTEN 蛋白表达的影响COX-2 在空白组主要以强阳性和阳性表达为主，在含药血清干预组中，细胞着色逐渐变浅，COX-2 蛋白的阳性表达率由与空白组相比明显下降; 促凋亡基因Bax 在空白组中呈阴性或是弱阳性表达，在含药血清干预组中，细胞着色逐渐变深，呈阳性或强阳性表达，Bax 蛋白的阳性表达率与空白组相比上升; 抑癌基因PTEN 蛋白着色逐渐变深，表达逐渐增强，呈强阳性或阳性表达，而空白组细胞着色较浅，呈弱阳性或阴性表达。
4 讨论
胃癌是我国常见的肿瘤之一，其发病率和死亡率均居各类肿瘤的首位，因为早期胃癌无特异性的症状，所以大多数患者在就诊时就已到中晚期，而此时预后效果极差，常常因为术后复发或癌细胞侵袭转移而扩散到其他部位而死亡。肿瘤的发生发展是癌基因激活与抑癌基因受抑制的结果，并受相关基因的影响，其mRNA 与蛋白的表达量亦影响癌细胞的发展与恶性肿瘤的预后。本研究从COX-2，Bax，PTEN 3 个不同方向的相关基因探讨抑制肿瘤的机制，为寻找新的药物对其作用加以调控可能对胃癌治疗带来新的策略。
COX 是前列腺素( PGs) 合成的关键限速酶。COX-2 的表达与胃癌的浸润深度密切相关，研究表明表达COX-2 的细胞能够直接附着于基底膜，破坏基底膜的完整性，从而改变细胞的黏附性，促进肿瘤的浸润转移。Hp 黏附于胃黏膜上皮，其释放的毒力因子直接与上皮细胞接触，而胃黏膜上皮损伤诱导COX-2 表达Hp 感染可刺激诱导COX-2 的白细胞介素8( IL-8) ，血管内皮生长因子( VEGF) 等因子的释放。本实验研究表明，当归贝母苦参丸含药血清作用于胃癌细胞可以明显降低COX-2 的表达量，推测可通过抑制COX-2 的表达降低细胞间黏附的E-钙黏蛋白活性，减弱肿瘤细胞的侵袭能力。Bax 基因是Bcl-2 基因家族内的同源基因，Bax基因表达异常与多种肿瘤发生密切相关。Bax 缺失在肿瘤的发生中起重要的作用，研究发现在多种肿瘤中存在Bax 基因的低表达。Kra-jewski检测了119 例乳腺癌，发现Bax 缺失率为34%，而正常的乳腺上皮细胞Bax 阳性率为97%。Bax 表达与胃癌的关系研究不多，本研究结果显示当归贝母苦参丸含药血清使胃癌细胞中Bax 表达阳性率为99. 7%，从而抑制Bcl-2 功能，加速细胞凋亡，抑制胃癌细胞的生长对胃癌发生、发展过程中可能起重要作用。PTEN 是具有磷酸酶活性的抑癌基因，参与细胞生长调节，并在肿瘤细胞浸润、转移中起一定作用，恶性肿瘤的发生发展与PTEN 缺失和突变有关，各类癌的总突变率为5% ～ 40%。PTEN 基因突变可以降低瘤组织中脂质磷酸酶活性，刺激肿瘤细胞生长并抑制凋亡。研究表明: PTEN 蛋白的表达与淋巴结转移、侵袭程度密切相关。胃癌组织中PTEN 基因的检测可了解与判断肿瘤增生，侵袭及转移的能力和程度。本实验研究表明，当归贝母苦参丸含药血清作用于胃癌细胞可以升高PTEN的表达量，从而抑制DNA 的复制; PTEN 升高，去磷酸化作用增强，从而抑制细胞周期，诱导细胞凋亡和分化，抑制其转移。
当归贝母苦参丸出自张仲景《金匮要略》。现代药理学研究证实，当归中多糖和阿魏酸可以抑制肿瘤增殖，是诱导肿瘤细胞凋亡或分化的天然诱导剂。贝母皂苷具有抗肿瘤作用。朱晓伟等研究表明: 苦参碱和氧化苦参碱作用人胃癌SGC-7901 细胞后，可增加G0 /G1期细胞所占百分比，降低S 期和G2 /M 期细胞百分比。李伏娥等证实苦参碱对人胃癌( SGC-7901) 细胞具有明显抑制作用，诱导细胞凋亡并抑制端粒酶活性。本方中当归为君药，养血和血，行气活血，补虚扶正，增强机体攻癌毒的能力补虚扶正; 贝母化痰散结，苦参清热利湿解毒，共为臣药; 当归贝母苦参丸作为抗肿瘤的方剂，为古方新用，针对肿瘤的病因病机特点，全方药物切中肿瘤的病因病机，有活血补血，化痰散结，清热解毒祛湿之效，本实验研究结果显示当归贝母苦参丸通过对COX-2，Bax，PTEN 因子影响来抑制胃癌细胞的生长，但关于当归贝母苦参丸抑制胃癌细胞增殖的机制仍需进一步研究。
